从150～250 mL菌液中纯化500～1200 μg无内毒素质粒DNA

1. 质粒拷贝数：纯化中低拷贝的质粒时，使用2倍的菌液体积，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同体积的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer。
2. 转化菌: 若为-70oC甘油冻存的菌，请先涂布平板培养后，再重新挑选新的单个菌落进行培养。切勿直接取冻存在4^oC的菌进行培养。
3. 柱结合能力：1 mg
4. 对富含内源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，请使用产品PD1713。

1. 取100 µL新鲜的菌液接种到150-200 mL （勿超过 200 mL）的LB培养基（含适量抗生素），37^oC震荡培养14-16小时。室温下5,000 x g离心10分钟，收集菌体，并尽可能的吸去上清。
2. 加入10 mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液器或涡流震荡确保菌体充分悬浮。
3. 加入 10 mL Buffer B1, 轻轻地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清。 
4. 加入2 mL Buffer N3, 立即反转5次，用手用力摇晃3-5次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
5. 将离心管转至高速离心机，在室温下12,000 x g离心10分钟（若上清中有白色沉淀，可再次离心）。
6. 定量吸取离心后的上清液至新的50 mL管中（避免吸起沉淀），加入0.1 volume的EndoClean Buffer，混匀后冰浴10分钟，其间不时摇匀（若EndoClean Buffer粘稠难吸，可将枪头剪掉头后再吸取）。
7. 取出后65^oC温浴5分钟，室温下（务必使溶液温度恢复到23^oC以上，否则溶液不分层）12,000 x g离心10分钟（也可在2,500 x g离心15分钟）。此时溶液分为两层，上层水相含有质粒，下层红色有机相含有内毒素。
8. 将上层水相转移至一个新的50 mL管中，加入10 mL的Buffer N3及12 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混匀，需马上离心过DNA柱。
9. 立即将20 mL裂解液/乙醇混合液转移至带收集管的DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。将剩余溶液转移至DNA柱中，室温下> 2,500 x g离心5分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复直至所有的溶液通过DNA柱。
10. 向离心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室温下> 2,500 x g 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中。重复步骤“11”。
11. 将离心柱放回高速离心机中，室温下> 2,500 x g开盖离心10分钟，以*去除残留的乙醇。
12. 将离心柱转至一个新的50 mL离心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5-1 mL的Endofree Elution Buffer，室温放置1分钟，5,000 x g 离心5分钟，以洗脱质粒DNA。若想提高得率，将50 mL离心管中的洗脱液再加到柱的中间，5,000 x g离心5分钟以洗脱质粒DNA。

操作流程：