PITC 衍生法分析 18 种氨基酸

PITC 衍生法分析 18 种氨基酸

方法：适用于 ChP. 2015 二部中《复方氨基酸注射液中氨基酸的测定》氨基酸分析步骤

1. 原理

这种分析氨基酸的方法基于柱前衍生步骤，衍生化反应是在碱性条件下完成的，采用异硫氰酸苯酯和游离氨基酸反应生成的 PTC-氨基酸衍生物可于 UV 254nm 处被检测到。通过 PITC 衍生法改善的氨基酸分离，同样使其分析更有效。

图 1. PITC 氨基酸衍生原理

1. 试剂

三乙胺溶液：将 1.4mL 1mol/L 三乙胺溶液和 8.6mL 乙腈混合均匀；

异硫氰酸苯酯溶液：配成 12.5μL/mL 的异硫氰酸苯酯的乙腈溶液（即 0.1mol/L）;

18 种氨基酸标准溶液：溶解或稀释一定量的 18 种氨基酸于 0.1mol/L 盐酸中，配制成 0.5μmol/mL 的 18

种氨基酸标准溶液。

1. 衍生化

转移 200μL 的 18 种氨基酸标准溶液（或样品溶液）入 1.5mL 塑料管中，加入 100μL 三乙胺溶液和 100μL 异硫氰酸苯酯溶液，混合，至于室温下反应 1h 后，加入 400μL 正己烷，涡旋振荡 10min。取澄清的下层液，稀释三倍后，用 0.45μm 滤膜过滤后进样。

1. 液相色谱分析

色谱柱：ACE Excel SuperC18 5μm 250×4.6mm（货号：EXL-1211-2546U）

流动相：A：0.1mol/L 醋酸钠溶液（用稀醋酸调节 pH 值至 6.5）-乙腈（93：7） B：乙腈-水（80：20）

流速：1ml/min

进样体积： 5μl 检测波长：254nm 柱温：36℃

注：这里梯度供参考，可根据仪器实际情况进行适当调整

1. ASP，天冬氨酸；2. Glu，谷氨酸；3. Ser，丝氨酸；4. Gly，甘氨酸；5. His，组氨酸；

6. Arg，精氨酸；7. Thr，苏氨酸；8. Ala，丙氨酸；9. Pro，脯氨酸；10. Tyr，酪氨酸；

11. Val，缬氨酸；12. Met，甲硫氨酸；13. Cys，胱氨酸；14. Ile，异亮氨酸；

15. Leu，亮氨酸；16. Phe，苯丙氨酸；17. Trp，色氨酸；18. Lys，赖氨酸。